欢迎大家订阅电转染小课堂，本期我们将详细介绍如何使用电穿孔技术对酿造酵母进行基因工程。本文中我们将使用ECM 630或Gemini X2（指数衰减波）电穿孔仪为酿酒酵母提供理想的电穿孔参数。
随着人们越来越重视身体健康，以及有关酒后驾驶的更严格法律规定。消费者对低酒精或无酒精啤酒的追求不断增加，这也激励了各啤酒厂扩大对低酒精啤酒的生产。目前生产低酒精啤酒的方法，包含控制发酵或发酵后去除乙醇，但是会导致味道变差或香气成分损失。此外，通过蒸馏或透析来去除乙醇是昂贵且费力的。因此，通过向啤酒厂提供一种转基因酵母菌株，使其在麦芽汁糖的完全发酵过程中产生较少的乙醇，可以建立一种生产乙醇含量较低的啤酒的替代技术。
研究人员Elke Nevoigt等［1］使用电穿孔技术对工业啤酒酿造酵母进行了基因改造，以实现降低啤酒中酒精含量的目标。先前的研究表明，GPD1基因（编码甘油－3－磷酸脱氢酶）的过表达可以改变实验室酵母菌菌株的发酵，使其产生更少的乙醇和更多的甘油。因此，为了验证这种方法是否可以用于降低乙醇含量的啤酒的发酵，该团队创建了一个质粒表达构建体，可以在工业啤酒酿造酵母中过度表达GPD1基因。然后，研究人员用GPD1表达构建体对酿酒酵母进行了电穿孔，并在与工业上生产啤酒的相同条件下进行发酵实验，发酵麦芽汁。发酵之后，该小组测量了发酵的产物，如乙醇和甘油，以及其他影响啤酒口感的发酵产物，如乙醛、丙酮和双乙酰。通过这种方法，研究人员成功地将啤酒中的乙醇含量降低了18％，甘油的产量提高了5．6倍。
以下是使用BTX ECM 630或Gemini X2电穿孔仪对酿酒酵母进行理想转化的方法的总结。使用此方案可实现每微克质粒载体DNA高达1 x10 8转化体的转化效率。
1． 在YPD培养基中将酿酒酵母培养到对数生长期；
2． 离心并洗涤沉淀的细胞数次以除去细胞培养基，并将细胞悬浮在电穿孔缓冲液中，密度为1．6 x 10 9cell／ml；
3． 在以下条件下在2 mm电极杯或2 mm间隙高通量电穿孔板中进行电穿孔细胞：
· 温度：4°C
· 电压：2500 V
· 电容：25 uF
· 电阻：100至200 Ω
· 脉冲数：1
· 所需电场强度：12．5 kV／cm
· 所需时间常数：3至4．5 ms
4． 将细胞置于回收培养基（1M山梨糖醇与YPD培养基的比例为1：1）中，于30°C孵育1 h；
5． 继续进行所需的选择方法，按照要求的选择方法进行。
Reference：
［1］． Nevoigt， E．， et al． Engineering of brewing yeast to reduce the content of ethanol in beer． FEMS Yeast Research 2002； 2： 225–232．
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